In diesem Artikel werden verschiedene Methoden der Gentechnik erklärt.
In der Gentechnik gibt es einige wichtige Methoden, um zu Arbeiten. Essentiell ist dabei vor allem, dass DNA-STück identifiziert und vervielfältigt werden können.
Meist liegt zu Beginn nur sehr wenig DNA für Arbeitstechniken zur Analyse der Genome vor. Um ein funktionierendes Verfahren durchzuführen muss daher vorher die DNA vervielfältigt werden.
Da beim Vervielfältigen aber meist Bestandteile wie Primer verwendet werden müssen, benötigt man schon ein gewisses Maß an Wissen über die Sequenz um diese richtig auszuwählen.
Gensonden
Die Gensonde ist ein markiertes (manchmal radioaktiv) Stück RNA oder DNA. Bindet dieses komplementär an die Genomsequenz, lässt sich der Ort dieser Sequenz identifizieren, indem man das markierte Stück findet. Ein Stück ist ca. 15-100 Basen lang.
Gensonden-Test
Die Gensonde wird hergestellt, indem man ein Fragment eines Gens oder einer Sequenz markiert.
Die zu testende Nucleinsäuresequenz wird zugänglich gemacht.
Sonde und Sequenz werden zusammen gegeben, sodass sich die Sonde komplementär anlagert.
Der restliche Einzelstrang wird abgetrennt und die hybridisierte Stelle mit der Gensonde identifiziert.
cDNA
Die cDNA wird aus RNA (meist mRNA) hergestellt. Dafür wird das Enzym reverse Transkriptase verwendet. Normalerweise existiert die cDNA nicht im menschlichen Körper, Viren verwenden aber genau diesen Weg um ihre RNA im Wirt in eine doppelsträngige DNA umzuwandeln.
Praktisch für Gencloning und andere Prozesse ist das Fehlen der Introns in der cDNA im Gegensatz zur DNA.
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
… als Kombination aus PCR und der reversen Transkriptase
Erste PCR
Die cDNA lagert sich an der mRNA an und hybridisiert mit dieser zu einem RNA-DNA-Doppelstrang.
Enzyme bauen den mRNA-Teil des Strangs ab.
Zweite PCR
cDNA wird durch eine DNA-Polymerase zum cDNA-Doppelstrang umgeschrieben
PCR
Die Polymerase-Kettenreaktion wird verwendet um eine kleine Menge DNA zu vervielfältigen um genug vorliegen zu haben um damit weiter zu arbeiten. Wichtig ist hierbei, dass ein kleines Stück bereits bekannt ist, um den richtigen Primer wählen zu können.
Komponenten des PCR-Ansatzes
Matrizen-DNA
Primer
dNTPs (also dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Puffer (für den richtigen ph-Wert)
Mg
Taq-Polymerase
Gelelektrophorese
Ablauf
Denaturierung: Die DNA wird für wenige Minuten bei 95°C aufgeschmolzen, dann zwei Einzelstränge entstehen
Annealing: Die Primer werden bei 55°C zugegeben und binden an der DNA
Extension: Bei erhöhter Temperatur von 72°C wird die taq-Polymerase zugegeben. Diese vervollständigt die Einzelstränge zu Doppelstränge. (ca. 1kb pro 60min)
Die Stränge werden erneut bei 95°C aufgeschmolzen.
Neue Primer werden hinzu gegeben und die neuen Doppelstränge synthetisiert.
Die Synthese stoppt und die Fragmente sind fertig.
Dieser Vorgang wird 30x wiederholt um die Fragmente zu vervielfältigen.
Mit einem Auftragspuffer wird die Lösung auf ein Gel aufgetragen.
Mittels elektrischer Spannung wandern die Fragmente durch das Gel.
Gelelektrophorese
Bei der Gelelektrophorese wandert die negativ geladenen DNA aufgrund der elektrischen Spannung durch das Gel von der Kathode (-) zur Anode (+). Große Fragmente bleiben im oberen Teil des Gels, kurze Fragmente wandert weit. Anhand einer Vergleichsprobe, von der man die Fragmentlängen weiß, lassen sich die entstandenen Längen bestimmen.
