Eine Grundlegende Technik um Bakterienzellen genetisch zu verändern ist die Transformation eines genetisch veränderten Pasmids/Vektors in die Bakterien. Das bedeutet, dass eine ringförmige DNA (= Plasmid/Vektor), welche ein Stück DNA mit einem gewünschten Gen (z.B. zur Insulinproduktion) enthält, in ein Bakterium gebracht wird, sodass das Bakterium davon Gebrauch macht und mit dem neuen Gen z.B. Insulin herstellt.
Das klingt sehr komplex, verläuft aber nach einem einfachen Prinzip.
Das Plasmid
Ein Plasmid ist eine ringförmige DNA mit spezifischen Stellen:
ori = origin of replication, also der Ursprung der Replikation.Diese Stelle ist wichtig, dass das Plasmid vervielfältigt werden kann.
Polylinker = Restriktionsschnittstellen. Hier können bestimmte Enzyme das Plasmid aufschneiden.
lacZ = Selektionsmarker (hier: Blau-Weiß-Selektion). Diese Stelle ist wichtig um am Bakterium zu überprüfen, ob das DNA-Stück mit dem gewünschten Gen in das Plasmid eingebaut wurde.
amp = Selektionsmarker (hier: Antibiotikaresistenz). Diese Stelle ist wichtig, um am Bakterium überprüfen zu können, ob das Plasmid auch wirklich aufgenommen wurde.
Insertion eines DNA-Stückes in das Plasmid
Restriktionsenzyme
Diese Enzyme erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden nach einem für sie spezifischen Muster.
Das bedeutet, dass verschiedene Restriktionsenzyme an verschiedenen oder auch gleichen Stellen des Plasmids schneiden können, wobei jedes Enzym eine bestimmte Sequenz als Erkennungsstelle hat.
Es können auch mehrere Enzyme die gleiche Erkennungssequenz besitzen, das Plasmid an dieser Sequenz aber auf verschiedene Weise schneiden.
Je nachdem, wie das Plasmid aufgeschnitten wurde, entstehen dadurch verschiedene Enden. Möchte man dann ein kleines DNA-Stück in das Plasmid inserieren (= einbauen), so müssen die Enden der kleinen DNA genau zu den Enden des aufgeschnittenen Plasmids passen.
Beispiel:
Enzym-A und Enzym-B haben die obenstehende Sequenz als Erkennungssequenz.
Enzym-A schneidet entlang der grünen Linie
Enzym-B schneidet exakt in der Mitte zwichen AA-TT und TT-AA
Vorgang der Restriktion und Insertion
Restriktion
Hat man ein bestimmmtes kleines DNA-Stück, das man in das Plasmid einbauen will, so muss zuerst das Plasmid spezifisch aufgeschnitten werden. Dazu wählt man ein Restriktionsenzym, das zum DNA-Stück passende Enden schafft.
Gibt man das Plasmid und das passende unter optimalen Bedingungen für das Enzym zusammen, so wird im einfachsten Fall aus dem ringförmigen Plasmid eine lineare DNA.
Insertion
Wird die lineare Plasmid-DNA mit den kurzen DNA-Stücken gemischt und das Enzym Ligase (= ligieren; verbinden) zugegeben, so lagern sich die Enden passend zueinander an und die Ligase verbindet die überlappenden Basen unter ATP-Verbrauch durch Wasserstoffbrückenbindungen.(siehe Bild: rot=DNA-Stück im Plasmid)
In dem oben vorgestellten Plasmid pUC19, befinden sich die Restriktionsschnittstellen im Bereich des lacZ-Gens. Wird nun mitten in diesem Gen ein Schnitt gemacht und dort das DNA-Stück eingefügt, so funktioniert die Herstellung des lacZ-Genproduktes nicht mehr.
Diesen Effekt machen sich Genetiker zu Nutzen und nennen das Vorgehen:
Blau-Weiß-Selektion
Blau-Weiß-Selektion:
Wenn ein Bakterium das normale Plasmid mit funktionierendem lac-Z-Gen beszitzt, so kann es auf einem bestimmten Medium (z.B. in einer Petrischale mit bestimmten "Futter") einen blauen Farbstoff herstellen. Die wachsenden Bakterienkolonien sind dann als blaue Punkte zu erkennen.
Wurde ein DNA-Stück in das Plasmid eingebaut, so ist das lac-Z-Gen kaputt. Damit können Bakterien mit diesem Plasmid keinen blauen Farbstoff mehr herstellen. Die wachsenden Bakterienkolonien sind daher als weiße Punkte zu erkennen.
Da der Genetiker die Bakterien nutzen möchte, die das DNA-Stück enthalten, nimmt er sich die weißen Kolonien um damit weiter zu arbeiten
Transformation eines Plasmids in ein Bakterium
Gibt man Bakterien in einer Lösung und die Plasmide zueinander, so wird das Plasmid nicht automatisch in ein Bakterium aufgenommen. Setzt man die Bakterien aber einem kurzen Hitzeschock oder Elektroschock aus, so nehmen diese ein Plasmid auf.
Natürlich haben nach dem Prozess nicht alle Bakterien ein Plasmid aufgenommen, weshalb man eine Antibiotikaresistens zum aussortieren verwendet. So besitzt das Plasmid pUC19 ein Gen für eine Ampicillin-Resistenz. Normalerweise könnten die Bakterien auf einem medium mit Ampicillin nicht wachsen, haben sie allerdings ein Plasmid aufgenommen, so sind sie mit dem darauf vorhandenen Gen resistent und bilden Kolonien.Im Gegensatz zur Blau-Weiß-Selektion kann nun mit allen gebildeten Kolonien weiter gearbeitet werden, da nur die interessanten Bakterien wachsen konnten.
Im Fall der Insulinproduktion, hat der Genetiker am Ende die Ausgangsbakterien vorliegen, aus denen er tausende Kolonien züchten kann um Insulin herstellen zu lassen.
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